Alkalna proteaza

Uporaba in načelo

Ta alkalna proteaza se uporablja za določanje proteazne aktivnosti, izražene kot PC enote, pripravkov, pridobljenih iz Bacillus subtilis var. in Bacillus licheniformis var. Analiza temelji na 30-minutni proteolitični hidrolizi kazeina pri 37 ° in pH 7,0. Nehidrolizirani kazein odstranimo s filtracijo in raztopljeni kazein določimo spektrofotometrično.

Reagenti in raztopine alkalne proteaze
Kazein Uporabljajte Hamzarstenov kazein (United States Biochemical Corp., kataloška št. 12840 ali enakovredno).
Tris pufer (pH 7,0) Raztopite 12,1 g encimskega (ali enakovrednega) tris (hidroksimetil) aminometana v 800 ml vode in titrirajte z 1 N klorovodikovo kislino na pH 7,0. Prenesite v 1000-mililitrsko merilno bučko, razredčite z vodo do oznake in premešajte.
Raztopina TCA Raztopite 18 g trikloroocetne kisline in 19 g natrijevega acetata trihidrata v 800 ml vode v 1000-mililitrski merilni bučki, dodajte 20 ml ledocetne kisline, razredčite z vodo in premešajte.
Raztopina substrata Raztopite 6,05 g tris (hidroksimetil) aminometana z encimskim razredom v 500 ml vode, dodajte 8 ml 1 N klorovodikove kisline in premešajte. V tej raztopini raztopite 7 g kazeina in med občasnim mešanjem segrevajte 30 minut v vreli vodni kopeli.
Ohladimo na sobno temperaturo in z 0,2 N klorovodikovo kislino naravnamo pH na 7,0, počasi z močnim mešanjem dodajamo kislino, da preprečimo obarjanje kazeina. Zmes prenesite v 1000-mililitrsko merilno bučko, razredčite z vodo do volumna in premešajte.

Priprava vzorca Z uporabo pufra Tris pripravimo raztopino vzorčnega encimskega pripravka, tako da bo 2 ml končne razredčitve vsebovalo med 10 in 44 enot bakterijske proteaze.

Postopek alkalne proteaze
V vsako serijo 25- × 150-milimetrskih epruvet odpipetirajte 10,0 ml raztopine za substrat, tako da omogočite eno epruveto za vsak encimski test, eno epruveto za slepo encimsko slepo in eno epruveto za slepo substrat. Epruvete uravnotežite 15 minut v vodni kopeli pri 37 ° ± 0,1 °.
Zaženite štoparico ob ničemer, hitro napipetirajte 2,0 ml pripravka vzorca v uravnotežen substrat. Zmešajte in cevi zamenjajte v vodni kopeli. Dodajte 2 ml Tris pufra (namesto Priprave vzorca) na prazno podlago. Po natanko 30 minutah dodajte 10 ml raztopine TCA v vsako encimsko inkubacijo in na slepo podlago, da zaustavite reakcijo. Epruvete segrevajte v vodni kopeli dodatnih 30 minut, da se beljakovine popolnoma strdijo.
Na koncu drugega ogrevalnega obdobja vsako cev močno pretresite in filtrirajte skozi 11-cm Whatman No. 42 ali enakovreden filtrirni papir, pri čemer zavrzite prvih 3 ml filtrata.
[Opomba: Filtrat mora biti popolnoma čist.]
Z ustreznim spektrofotometrom določimo absorbanco vsakega vzorčnega filtrata v 1-cm celici pri 275 nm z uporabo filtrata iz slepe podlage, da nastavimo instrument na nič. Vsak odčitek popravite tako, da odštejete ustrezen odčitek encimskega slepega prostora in tako dobljeno vrednost zabeležite kot AU.

Standardna krivulja Prenesite 100,0 mg L-tirozina, kromatografsko ali enakovredno (Aldrich Chemical Co.), predhodno posušenega do konstantne teže, v 1000-mililitrsko merilno bučko. Raztopite v 60 ml 0,1 N klorovodikove kisline. Ko se raztopina popolnoma raztopi, raztopino razredčite z vodo in temeljito premešajte. Ta raztopina vsebuje 100 µg tirozina v 1,0 ml. Iz te osnovne raztopine pripravite še tri razredčitve, ki vsebujejo 75,0, 50,0 in 25,0 µg tirozina na ml. Določite absorbanco štirih raztopin pri 275 nm v 1-cm celici na ustreznem spektrofotometru v primerjavi z 0,006 N klorovodikovo kislino. Pripravite grafikon absorpcije v primerjavi s koncentracijo tirozina.

Izračun alkalne proteaze
Ena enota bakterijske proteaze (PC) je opredeljena kot tista količina encima, ki proizvede ekvivalent 1,5 µg / ml L-tirozina na minuto pod pogoji preskusa.
Iz standardne krivulje in z interpolacijo določite absorbanco raztopine s koncentracijo tirozina 60 µg / ml. Dobiti je treba številko blizu 0,0115. Interpolirano vrednost delimo s 40, da dobimo absorbanco, enakovredno absorpciji raztopine s koncentracijo tirozina 1,5 μg / ml, in tako izpeljano vrednost zapišemo kot AS.
Po enačbi izračunajte aktivnost vzorčnega encimskega pripravka

PC / g = (AU / AS) × (22 / 30W)

pri čemer je 22 končni volumen reakcijske zmesi v ml; 30 je čas reakcije v minutah; in W masa, v gramih, odvzetega prvotnega vzorca.

Pakiranje in skladiščenje alkalne proteaze

Trdna vrečka za pakiranje hrane, 25 kg / sod.

Alkalno proteazo je treba hraniti v suhih, hladnih in dobro prezračevanih prostorih stran od sonca in toplote.

Plačilo:T / T, Paypal, Western Union, Alibaba Trade Assurance, VISA, MasterCard, e-preverjanje, plačilo pozneje, LC itd.