Kislinska proteaza

Uporaba in načelo

Ta kisla proteaza se uporablja za določanje proteolitične aktivnosti, izražene kot enote hemoglobina na osnovi tirozina (HUT), pripravkov, pridobljenih iz Aspergillus oryzae var in Aspergillus niger var, in se lahko uporablja za določanje aktivnosti drugih proteaz pri pH 4,7 . Test temelji na 30-minutni encimski hidrolizi substrata hemoglobina pri pH 4,7 in 40 °. Nehidroliziran substrat oborimo s trikloroocetno kislino in odstranimo s filtracijo. Količina raztopljenega hemoglobina v filtratu se določi spektrofotometrično.

Reagenti in raztopine kislinske proteaze
Hemoglobin Uporabite prašek za podlago za hemoglobin (Sigma Chemical Co., kataloška št. H2625) ali podoben visokokakovosten material, ki je popolnoma topen v vodi.
Raztopina acetatnega pufra Raztopite 136 g natrijevega acetata (NaC2H3O2 · 3H2O) v toliko vode, da dobite 500 ml. 25,0 ml te raztopine zmešajte s 50,0 ml 1 M ocetne kisline, razredčite do 1000 ml z vodo in premešajte. PH te raztopine mora biti 4,7 ± 0,02.
Raztopina substrata Prenesite 4,0 g hemoglobina v 250-mililitrsko čašo, dodajte 100 ml vode in mešajte 10 minut, da se raztopi. V raztopino potopite elektrode pH-metra in med neprekinjenim mešanjem nastavite pH na 1,7 z dodajanjem 0,3 N klorovodikove kisline. Po 10 minutah nastavite pH na 4,7 z dodajanjem 0,5 M natrijevega acetata. Raztopino prenesite v 200-mililitrsko merilno bučko, razredčite z vodo do oznake in premešajte. Ta raztopina je v hladilniku stabilna približno 5 dni.
Raztopina trikloroocetne kisline Raztopite 140 g trikloroocetne kisline v približno 750 ml vode. Raztopino prenesemo v 1000-mililitrsko merilno bučko, do oznake razredčimo z vodo in temeljito premešamo.

Priprava vzorca Količino vzorca raztopite v raztopini acetatnega pufra, da dobite raztopino, ki vsebuje v vsakem ml med 9 in 22 HUT. (Takšna koncentracija bo v spodnjem postopku dosegla odčitek absorbance v želenem območju od 0,2 do 0,5.)

Postopek kislinske proteaze
V vsako serijo 25- × 150-milimetrskih epruvet odpipetirajte 10,0 ml raztopine substrata: eno za vsak encimski test in eno za slepo podlago. Epruvete segrevajte v vodni kopeli pri 40 ° približno 5 minut. V vsako epruveto, razen slepe podlage, dodajte 2,0 ml pripravka vzorca in začnite meriti čas reakcije v trenutku, ko dodate raztopino; dodajte 2,0 ml raztopine acetatnega pufra v slepo cev za substrat. Zaprite epruvete z gumijastimi zamaški št. 4 in vsako cev nežno tapkajte 30 sekund po dlani, da se premešajo. Vsako epruveto segrevajte v vodni kopeli pri 40 ° natančno 30 minut in nato v vsako epruveto na hitro vpipajte 10,0 ml raztopine trikloroocetne kisline. Vsako epruveto približno 40 s močno stresamo proti zamašku, nato pa pustimo, da se 1 uro ohladi na sobno temperaturo, v tem obdobju pa vsako epruveto stresamo ob zamašek v intervalih od 10 do 12 minut. Pripravite encimske presledke, kot sledi: V ločenih epruvetah segrejte 10,0 ml raztopine substrata in približno 5 ml pripravka vzorca v vodni kopeli 30 minut, nato pa raztopini substrata dodajte 10,0 ml raztopine trikloroocetne kisline, dobro pretresite 40 s in tej zmesi dodamo 2,0 ml predhodno ogretega pripravka vzorca. Ponovno pretresite in 1 uro ohlajajte pri sobni temperaturi s stresanjem v intervalih od 10 do 12 minut.
Po 1 uri vsako epruveto močno pretresite in filtrirajte skozi 11-cm Whatman No. 42 ali enakovreden filtrirni papir ter ponovno filtrirajte prvo polovico filtrata skozi isti papir. Z ustreznim spektrofotometrom določimo absorbanco vsakega filtrata v 1-cm celici pri 275 nm z uporabo filtrata iz slepe podlage, da nastavimo instrument na nič. Vsak odčitek popravite tako, da odštejete ustrezen odčitek encimskega slepega prostora in tako dobljeno vrednost zabeležite kot AU.
[Opomba: Če popravljene vrednosti absorbance med 0,2 in 0,5 ne dobimo, preskus ponovite z uporabo več ali manj encimskega pripravka, če je potrebno.]

Standardna krivulja Prenesite 100,0 mg L-tirozina, kromatografsko ali enakovredno (Aldrich Chemical Co.), predhodno posušenega do konstantne teže, v 1000-mililitrsko merilno bučko. Raztopite v 60 ml 0,1 N klorovodikove kisline. Ko se L-tirozin popolnoma raztopi, raztopino razredčimo z vodo in temeljito premešamo. Ta raztopina vsebuje 100 µg tirozina v 1,0 ml. Iz te osnovne raztopine pripravite še tri razredčitve, ki vsebujejo 75,0, 50,0 in 25,0 µg tirozina na ml. Določite absorbanco štirih raztopin pri 275 nm v 1-cm celici na ustreznem spektrofotometru v primerjavi z 0,006 N klorovodikovo kislino. Pripravite grafikon absorpcije v primerjavi s koncentracijo tirozina. Določite naklon krivulje glede na absorpcijo na µg tirozina. Pomnožite to vrednost z 1,10 in jo zapišite kot AS. Dobiti je treba vrednost približno 0,0084.

Izračun kislinske proteaze
Ena HUT enota proteolitika (kisla proteaza) aktivnost je opredeljena kot tista količina encima, ki v 1 minuti pod določenimi pogoji ustvari hidrolizat, katerega absorpcija pri 275 nm je enaka absorpciji raztopine, ki vsebuje 1,10 µg / ml tirozina v 0,006 N klorovodikovi kislini.
Po enačbi izračunamo HUT na g prvotnega encimskega pripravka

HUT / g = (AU / AS) × (22 / 30W)

pri čemer je 22 končni volumen preskusne raztopine; 30 reakcijski čas v minutah; in W masa, v gramih, odvzetega prvotnega vzorca.

[Opomba: Vrednost AS v skrbno nadzorovanih in standardiziranih pogojih znaša 0,0084; ta vrednost se lahko uporablja za rutinsko delo namesto vrednosti, pridobljene s standardno krivuljo, vendar je treba za natančnejše rezultate in v dvomih uporabiti natančno vrednost, izračunano iz standardne krivulje.]

POTRDILO O ANALIZI

ime izdelka	Kislinska proteaza
Drugo ime	N / A	Država izvora	Kitajska
Obremenitev	Aspergillus oryzae	Datum izdelave	13. MAJA 2019
Serijska številka	SP19050903	Datum veljavnosti	12. MAJA 2021
Paket	25 kg / vedro	Količina	100 kg
PROTOKOL	SPECIFIKACIJE	REZULTATI	METODA
FIZIKALNA IN KEMIJSKA ANALIZA
Opis	rjavi prah	Izpolnjuje	Vizualno
Vonj in okus	Značilen vonj in okus	Izpolnjuje	Okusite
Vlaga	7% NMT	5,1%	Analizator vlage
IDENTIFIKACIJA
Prepoznavna dejavnost	Pozitivno za aktivnost bromelaina	Izpolnjuje	In-house
DEJAVNOST
Aktivnost proteaz	500.000 NLT HUT / g	508.270 HUT / g	FCC VII
MIKROBIOLOŠKI
Skupno število bakterij Koliformne bakterije (CFU / g) Kalupi in kvasovke E. Coli Salmonela zlati stafilokok Pseudomonas aeruginosa	NMT 3.000 CFU / g NMT 30 CFU / g NMT 100 CFU / g Odsoten Odsoten Odsoten Odsoten	500 CFU / g ＜10 CFU / g ＜10 CFU / g Ni zaznan Ni zaznan Ni zaznan Ni zaznan	FDA BAM Online Ch.3 FDA BAM Online Ch.4 FDA BAM Online Ch. 2. FDA BAM Online Ch.4 FDA BAM Online Ch.5 FDA BAM Online Ch.12 AOAC
TEŽKE KOVINE
Svinec Živo srebro Kadmij Arzen	NMT 3 ppm NMT 0,1 ppm NMT 1 ppm NMT 1 ppm	0,21 ppm ± 0,1 ppm ＜1 ppm ＜1 ppm	USP <231> USP <231> USP <231> USP <231>
Skladiščenje: Shranjujte v hladnem in suhem prostoru, zaščitenem pred svetlobo, boben naj bo blizu, kadar ga ne uporabljate. Zaključek: V skladu s standardi IU. Rok uporabnosti: Rok uporabnosti kisle proteaze pri predpisanih pogojih skladiščenja in neprepustnem pakiranju bo 2 leti. Izdelek IZPOLNJA zgoraj navedene specifikacije Odobril RICKY H. ZHU pooblaščeni podpisnik

*The above information is a direct translation of the information provided to Newgen Biotech from the manufacturer of kisla proteaza. This Certificate of Analysis should be used for informational purposes and is not intended as a substitute for strict quality control analysis by the purchaser of this product.

Pakiranje in skladiščenje

Trdna vrečka za pakiranje hrane, 25 kg / sod.

Kislo proteazo shranjujte v suhih, hladnih in dobro prezračevanih prostorih stran od sonca in toplote.

Plačilo:T / T, Paypal, Western Union, Alibaba Trade Assurance, VISA, MasterCard, e-preverjanje, plačilo pozneje, LC itd.